АНТИГЕН БАЙЛАНЫСТЫРАТЫН ЛИМФОЦИТТЕРДІ АНЫҚТАУ ӘДІСТЕРІН ЖЕТІЛДІРУ туралы қазақша реферат

Қазіргі таңда әртүрлі аурулар диагностикасында иммунологиялық әдістерді кеңінен қолданады [1, 2]. Соңғы жылдары бұл мақсатта перифириялық қанда антиген байланыстыратын лимфоциттерді (АБЛ) қолдану мүмкіндігі туралы мәліметтер пайда болды. АБЛ, көптеген авторлардың пікірінше, жасуша мембранасында орналасқан арнайы рецепторлармен антигенді байланыстыру қабілеті бойынша бір топқа біріктірілген лимфоциттердің гетерогенді популяциясын көрсетеді.

АБЛ анықтауды бактериялық (дифтерия, бруцеллез, туберкулез, сифилис, ірің-қабыну және сепсистік аурулар, т.б.) және вирустық (кене энцефалиті) инфекциялары, сондай-ақ, деструкциялық-қабыну үрдістерінің (гломерулонефрит, пиелонефрит, тонзиллит, гепатит, панкреатит, т.б.) диагностикасында сәтті қолданылады [4].

АБЛ тесті үшін эритроциттік реагенттерді дайындау кезінде адам лимфоциттерімен кездейсоқ розеткалар түзбейтін тауық немесе бұқа эритроциттерін қолданады [5].

Алуан түрлі ұлпалық арнайылық АБЛ анықталуы бойынша патологиялық үрдіске жүрек, бауыр, бүйрек (қабық және ми қабаттары) ұлпалары, таңдай бадамы, дәнекер ұлпасы, тік және тоқ ішек, өт көпіршігі, басқа  мүшелер мен ұлпалардың қатысуы туралы айтуға болады [6].

Ауыр түрдегі бруцеллез бен өкпе туберкулезін анықтау кезінде сәйкес арнайылықтағы АБЛ анықтау 100 пайызды құрайды [7].

Дифтерия кезінде АБЛ анықтау әдісі ерте, сондай-ақ, кеш диагностика үшін қолданылуы мүмкін. Берілген әдістің бактериологиялық әдіске қарағанда артықшылығына ол антибиотиктерапия мен арнайы иммундық терапиядан тәуелсіз болуы жатады. Сонымен қатар, АБЛ ошақтарда дифтерияны науқастар мен токсигенді дифтерия коринобактерияларының тасушыларын ерте анықтау мақсатында анықтау үшін қолданылуы мүмкін.

АБЛ тестін сальмонеллездік және шигеллездік инфекциясымен ауыр ішек инфекциясымен науқастарда ерте және дифференциалдық диагностика әдісі ретінде Е.А.Славкомен қолданылды. Оның тиімділігі көрсетілді, тест жоғары сезімталдылық, түр және топтық арнайылықпен сипатталады.

Көптеген зерттеушілер еңбектерінің нәтижелері бойынша АБЛ зертханалық жануарларды жұқтыру немесе вакцинациясынан кейін алғашқы күндері және адамдардың ауырғаннан кейін алғашқы күндері анықталады.

Арнайылық антиген байланыстыратын лимфоциттердің тек гомологиялық антигендер мен АБЛ-дің тек гомологиялық антигендермен таңдамалы реакциясымен анықталуының доза тәуелді немесе конкурентті тежелуімен дәлелденген.

Иммунологиялық (T.pallidum арнайылықтағы АБЛ анықтау) және серологиялық әдістер кешенімен превентивті емдеудегі тұлғаларды параллельды зерттеу кезінде алынған мәліметтерді талдау кезінде АБЛ антиденелермен салыстырғанда 11,5 есе жиі анықталған. Бұл мәліметтер сифилистің ерте диагностикасының болашағын анықтайды. Сифилиспен науқастардың барлығында АБЛ анықтау жиілігі 97 % құраса, біріншілік сифилиспен науқастарда 100 % құрады.

Бұл тұрғыдан алғанда, әртүрлі антигендерден эритроциттік диагностикумдерді (ЭД) қолданумен розетка түзу реакциясының (РТР) көмегімен АБЛ құрамының динамикасын зерттеу үлкен қызығушылыққа ие.

Микроскоппен бақылағанда немесе бояу жолымен Т- және В-лимфоциттерді ажырату мүмкін емес. Клиникалық тәжірибе үшін қазіргі таңда әртүрлі моноклондық антиденелер арқылы анықталатын лимфоциттердің әртүрлі маркерлерін анықтау үлкен маңызға ие. Алайда, қымбат моноклондық антиденелер мен оларды қолдану үшін құралдардың қымбаттығын ескере отырып, клинико-диагностикалық зертханаларда лимфоциттердің розетка түзуінің әртүрлі модификацияларын қолданатын лимфоциттердің фенотиптеу әдістерін қолданады. Ең қарапайым әдіс Т- және В-жасушаларды анықтау бойынша розетка түзу әдісі болып табылады. Т-лимфоциттердің жасушалық мембранасының бетінде қой эритроциттеріне арнайы рецептор орналасса, В-лимфоциттер бетінде тышқан эритроциттеріне арнайы рецептор орналасқан. Бұл эритроциттер Т- және В-жасушаларына маркер қызметін атқарады: әрбір лимфоцит өзінің бетіне 4-ке дейін және оған сәйкес келетін эритроциттерді қосып, микроскоп астында жақсы ажыратылатын розетка түзеді. Сонымен қатар, Т-жасушалардың популяциясында теофеллин әсеріне төзімді жасушаларды ажыратады, бұл Т-хелперлік субпопуляция және төзімсіз (ТФ-сезімтал) Т-супрессорлық популяция. Егер лимфоциттерді алдын-ала теофиллинмен өңдеп, қой эритроциттерімен байланыстырса, онда розетка түзу реакциясы тек лимфоциттердің Т-хелперлік субпопуляциясымен өтеді. Бұл негізде лимфоциттердің субпопуляциясының пайыздық қатынасы туралы тұжырым жасайды.

Розетка түзу тесті – перифириялық қандағы антиген байланыстыратын лимфоциттерді анықтаудың негізгі әдісі – мембранада Т-, В-лимфоциттер мембранасында қой немесе тышқан эритроциттеріне рецепторлардың барлық субпопуляцияларының болуына және олармен берік  байланыс (розетка) түзу қабілетіне негізделген.

            Розетка түзу әдісімен АБЛ-ды жүргізу үшін келесі ингридиенттер мен жабдықтар қажет: 1. Гепарин; 2. Фиколл-верографин тығыздық градиенті (1,077-1,079 г/см); 3. 0,85 % натрий хлоридінің ерітіндісі; 4. 3 % сірке қышқылының ерітіндісі; 5. 0,1%-дық метилен көк ерітіндісі; 6. 95-96 % этил спирті; 7. пробиркалар, градуирленген және пастерлік пипеткалар, заттық және жабын әйнектер, пипеткалық дозаторлар (0,02 және 0,1 мл-ге), резиналық груша; 8. Горяев камерасы немесе жасушалардың автоматты есептеуіші; 9. Бинокулярлық микроскоп; 10. Көлденең роторы бар центрифуга; 11. Термостат (370С); 12. Тоңазытқыш (40С); 13. Жасушалар есептеуіші; 14. Ареометр.

Зерттеу үшін қанды көктамырдан 3 мл мөлшерде гепариндік пробиркаға алады.

Гепарин ерітіндісін дайындау. 1 мл-де 5000 бірліктен тұратын гепаринді натрий хлоридінің 1:9 қатынасындағы 0,85 % ерітіндісімен араластырады. Зерттелетін науқастан алынған әрбір мл қанға араластырылған гепариннің 0,05 мл мөлшерін алады.

Тығыздық градиентін дайындау. 9,76 г фиколл-400 және 120 мл суды, 20 мл 76%-дық кез-келген рентген-контрасттық препараттың ерітіндісін (урографин, верографин, триомбраст, тразограф) араластырады. Градиенттің үлестік салмағы 1,077 г/мл болады.

Лимфоциттерді бөліп алу. 1:1 қатынасындағы натрий хлоридінің 0,85%-дық ерітіндісімен араластырылған гепариндік қанды 3 мл тығыздық градиентіне қабаттайды және 35 минут 1500 айн/мин центрифугалайды. Интерфазадан лимфоциттерді  пастер пипеткасымен жинап, 5 мл 0,85 % натрий хлоридінің ерітіндісімен  1500 айн/мин кезінде 20 минут центрифугалайды. Лимфоциттер өлшемінің концентрациясын Горяев камерасында немесе жасушалар есептеуіші көмегімен анықтап, 1 мл-де 2*106 жасушаларға дейін келтіреді.

Глутар альдегидін жасау. 2 %-дық глутар альдегидын 1:7,3 қатынасында 0,85 % натрий хлоридінің ерітіндісімен  араластырады.

Үлгілерді бояу үшін 0,05 % метилен көк пен 0,5 % сусыз Na2CO3 тұратын сулы ерітіндісін дайындайды.

Параллельды түрде екі тест орындалады:

1. Тәжірибе

2. Бақылау

Зерттелетін науқастың 10 мл мөлшердегі қанын 1 мг гепаринге алып, шайқап, нөмірлейді. Пробиркаға 3 мл фиколл-верографин құйып, градиентке (фиколл-верографин (триомбраст, тразограф, урографин қолданылуы мүмкін)) пастер пипеткасымен  қанды тамызады. Центрифугаға 1,5-2,0 мың айн\мин кезінде 20-30 минутқа қоямыз. Басқа пробиркаға шамамен 5,0 куб физиологиялық ерітінді құйып, пастер пипеткасымен оралған пробиркадан лимфоциттер сақинасын алып, физерітіндіні қырына дейін құйып, центрифугаға  1,5 мың айн\мин кезінде 10 минутқа қоямыз. Үш рет айналдырған соң тұнбаүсті сұйықтықты төгіп тастайды, шамамен 0,5+ 0,4 + физерітінді= 0,7 7 үлгіге қалдырамыз. Кіші пробиркаларды антигендер саны бойынша нөмірлеп, дозатормен әр пробиркаға 0,05 лимфоциттен қосамыз (бақылауда антиген жоқ). Антигендер: 0,05-К, А, В, С, Рп7, Рп15, Hib. 1 тамшы глутар альдегидын жақсы шайқап, әйнек бетіне жағамыз. Үлгі кепкен соң үлгіні 960 спиртте бекітіп, метилен көк немесе Романовский-Гимза әдісімен бояймыз.Жасушаларды Горяев камерасында люминесцентті микроскопия кезінде жүргізеді. Розеткалар санын 700 лимфоцитке санап, Т-лимфоциттердің пайыздық қатынасын шығарады. Розеткаға кемінде 3 эритроцит байлайтын лимфоцитті санайды. Нәтиженің диагностикалық бағалауын тәжірибе мен бақылауда анықталған АБЛ құрамының сенімді айырмасын статистикалық анықтау негізінде жүргізеді. Олардың мөлшері арнайы реагентпен анықталған кезде бақылаушы реагентпен «розетка» түзетін лимфоциттер мөлшерінен асқанда (Р<0,05), анықталған деп саналады. Т-лимфоциттердің абсолюттік мөлшерін анықтау үшін зерттеу күні қанның жалпы клиникалық талдауын жүргізеді [8].

Қалыпты жағдайда перифириялық қандағы Т-лимфоциттің құрамы лимфоциттердің жалпы санынан 50-70% аралығында ауытқиды.

Қолданылған әдебиеттер тізімі:

  1. Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Акатов А.К. Ж.Микробиология, 1988, №1, 94-102 б.
  2. Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Ж.Микробиология, 1985, №6, 87-90 б.
  3. Чоудхури Мд.Юсуф. Антигенсвязывающие лимфоциты – их взаимосвязь с субпопуляциями Т-клеток и значение для иммунодиагностики ревматизма. Дисс,, канд., Алма-Ата, 1986, 125 б.
  4. Славко Е.А., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Карабеков А.Ж. Определение антигенсвязывающих лимфоцитов как метод ранней диагностики сальмонеллеза и острой дизентерии// Здравоохранение Казахстана, 1999, №5-6, 43-46 б.
  5. Прасолова Л.А. Диагностика стафилококковых и синегнойных гнойно-воспалительных и септических заболеваний по выявлению антигенсвязывающих лимфоцитов. Дисс. Канд.мед.наук, Алматы, 1990, 173 б.
  6. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Яковлев С.В. и др. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике. Пособие для врачей. М.; 2004.
  7. Жунусова Г.Б., Каральник Б.В., Динамика первого антигенспецифического этапа иммунного ответа на гоноккоковую вакцину\\Вестник КазНМУ.-Алматы.-2001.-№13.-88-90 б.

Есетова А.А.

Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің  студенті, Астана

Ғылыми жетекші: Ұқбаева Т.Д.

Assel-bt@mail.ru
Тағы рефераттар