Жасушалы селекцияда  бидайдың каллусты ұлпаларындағы  пероксидаза ферментінің белсенділігін зерттеу туралы қазақша реферат

Қазақстан Республикасы әлемдегі жоғары, сапалы бидайды шығаруына байланысты ең ірі мемлекеттің бірі болып табылады. Қазақстан Республикасының ауыл шаруашылығының негізгі және стратегиялық  маңызды бұтағы өсімдік шаруашылығы болып табылады. Солтүстік Қазақстанда бидайды 11,04 млн.га егеді, оның егу ауданы 62% -ға жетеді.

Қазіргі кезде жасушалық селекцияда биотехнологиялық әдістермен сонымен қатар селекциялық жұмыстармен өсімдіктердің иммунитетін индукциялауға қоздырғыштардың белгілі бір түрлерін кең қолданды. Бүгінгі күні  жасушалық селекция бағытында бағалы бастапқы түрлерді сұрыптау жолдарымен селективті факторларды қолданылады. Осы жолмен селективтік жағдайда төзімді каллус линияларын алу, олардан ауру қоздырғыштарына төзімді өсімдіктерді регенерациялауға мүмкіндік туғызады. Бүгінгі күні осы жол ең актуалды және перспективті болып табылады, өйткені селекцияның дәстүрлі әдістері бидайдың морфологиялық, физиологиялық күйін бақылап, керекті қоректік заттарын қоса отырып, бидайдың өнімділігіне және сапасына жақсы әсер етеді.

Жұмыстың мақсаты: Селективті ортада бидай сортының  каллус ұлпасын өсіріп, ондағы  пероксидаза ферментінің белсенділігін зерттеу.

Жұмыстың мақсатына жету үшін келесі зерттеу міндеттері  алға қойылды:

— Жасушалық  селекциясында алғашқы каллус ұлпасын алу;

— Пероксидаза ферментінің белсенділігін анықтау;

Зерттеу объектісі ретінде бидайдың Ақмола 2 сұрыбы пайдаланылды.

Бастапқы материал ретінде Қазақстан Республикасының Ұлттық Биотехнология Орталығының өсімдіктер селекциясы мен биотехнологиясы  зертханасынан сыпайы әкелген зертханалар қызметкерлерінің жаздық жұмсақ бидай сортын қолдандық.

Алғашқы  каллус ұлпаларын алу стандартты  әдіс бойынша жүргізілді. Эксплант ретінде жетілген  ұрық тұқымдары алынды. Тұқымдарды сабынды сумен жуып, 10минут ішінде 70% хлораминмен өндеп, автоклавтанған суда  ламинар-бокста 1 күнге қалдырдық. Келесі күні ламинар бокста  ассептикалық жағдайда тұқымдарды қайтадан 70% хлораминмен өндеп, 3 рет автоклавтанған сумен шайып, агарланған қоректік ортасы бар чашки Петриге  отырғыздық.

Оларды жарық жоқ жерде 26°С термостатта культивирлеуге  орнатылдық. Каллустардың пайда болуына 4 қоректік орта қолданылды:

1) бақылау Мурасиге және Скуг; 2) МС+0,3% NaCl; 3) МС+0,75% NaCl; 4) МС+1% NaCl;  Әр қоректік ортаны 0,5л мөлшерінде дайындадық. Бақылау Мурасиге және Скуга коректіқ ортада жүргізілді. минералдық ортаға  макротұздар 25мл, микротұздар 0,5мл, Fe-хелат 2,5мл, тиамин-НCl  0,5мл, мезоинозит -50 мг, 2,4Д-1,5мл, сахароза 15г, CaCl2-0,220мг, агар 3,5г және  рН ортасы -5,8. Осы ортаны автоклавта 0,8 атм. 30 мин. ішінде стерилдейді.

Клеткалық селекция.Бір сатылы клеткалық селекцияны жасаған кезде бидайдың ұрықтары  Мурасиге және Скуг қоректік ортасына қосылған натрий хлоридінің 0,3% үшін 1,5г, МС+0,75% NaCl ортасы үшін 3,75г NaCl және  МС+1% NaCl ортасы үшін 5г NaCl қосылып отырғызылған.

Өсімдік жасушаларында көптеген ферменттер болады. Олар өсімдік организміндегі биохимиялық реакцияларды жүргізуге қатысады. Сол ферменттердің бірі пероксидаза ферменті. Пероксидаза — тірі организмдерде кең тараған фермент. Бұл фермент өсімдіктің тіршілігінде көптеген үрдістерге- өсіп- дамуы, морфогенез, стресс факторынан қорғануға қатысады. Пероксидаза жасушаның белгілі бір факторлардан қорғаныш қызметін атқаратындықтан белсенділігі әсіресе фитопатогендермен зақымданған өсімдіктерде басымдылық көрсетеді. Пероксидаза химиялық табиғаты жағынан оксиредуктаза тобына жататын фермент, яғни сутегі асқын тотығы көмегімен тотығу процесін катализдейді де соның нәтижесінде көк түсті концентрация пайда болады. Тотығу реакциясы келесі сызба-нұсқа бойынша жүреді:

AH2+H2O2——-пероксидаза———-àA+2H2O

мұндағы AH2-сутегінің доноры; Ф- тотыққан донор;

Әр түрлі генотиптерге пероксидаза белсеңділігінің артуы әр қалай әсер етеді. Бұл сорттардың патогендерді қабылдау дәрежесіне байланысты. Төзімді генотиптерді іріктеуде жасушадағы пероксидаза белсенділігі төзімсіздермен салыстырғанда жоғары болады.

Зерттеуіміздің мақсаты әртүрлі селективті ортада өсірілген бидай каллус ұлпаларының құрамындағы пероксидаза белсенділігінің өзгеруін анықтау. Селективті агент ретінде – Мурасиге және Скуг қоректік ортасына қосылған натрий хлоридінің әр түрлі концентрациясы қолданылды.

Пероксидаза белсенділігін А.Н.Бояркиннің ұсынған әдісі бойынша анықталды. Бұл әдіс өсімдік клеткасы құрамындағы фермент әсерінен  бензидиннің тотығу реакциясының жылдамдығына, фотоэлектроколориметрде алдын-ала орнатылған белгілі концентрациялы көк түсті тотығу өнімінің түзілуіне негізделген.

        Бидайдың Ақмола 2 сортының каллустарынан 200 мг өлшеп алынып, алдын-ала дайындалған рн 4,7  ацетаттық буфері ерітіндісімен біркелкі массаға дейін кәрлен келілерде езілді де, буфердің көмегімен 50 мл колбаға құйылды. 10 минутке шейкер  араластырғышқа қойылды. Нәтижесінде   пероксидаза ферменті ерітіндіге айналды. Сол ерітінді 1,5 мл эппендоров пробиркаларына құйылып, 3000 айн/минутында 15 минут центрифугаланды. Шығарғасын тұнбадан басқа ерітіндіні, яғни үлгінің үстіңгі бөлігі  ферменттің белсенділігін анықтау үшін қолданылды.

Қобдишалар құрал ұясына орнатылып, оптикалық реттеушінің көмегімен жарық ағындары теңестірілді. Басында гальванометрдің тілшесін нөлге теңестіріп, кейін есеп жүргізу үшін гальванометрдің тілшесін  оң жаққа ауыстыру  үшін оң барабанды бұрамыз (экстинкция Е= 0,125 немесе 0,250). Содан соң сол жақтағы бақылау қобдишасына  2 мл дистелденген су, ал оң жақтағы тәжірибелі қобдишасына 2 мл 3% сутек асқын тотығы құйылды да, сол кезден бастап бірден секундомер іске қосылды. Пероксидаза ферменттінің әсерінен көк түсті қосылыстың түзілуімен  бензидиннің тотығу реакциясы жүреді. Оны 5-суреттен көруге болады.

Тәжірибелі қобдишасындағы ерітінді көгереді, гальванометрдің тілшесі оң жақ шеттен нөлдік белгіге бағытталады. Секундомерді гальванометрдің тілшесі нөлге жеткен кезде тоқтатып, кенет мезгіл белгіленеді. Ферменттің белсенділігін анықтағанда гальванометрдің тілшесі нөлге 20-50 секундтан кейін жеткен дұрыс болады.

Ферменттің белсенділігі (А) реакция жылдамдылығымен шартты бірлікпен есептеледі және 1г өсімдік материалына белгіленеді. Есептеуді  келесі формула бойынша  жүргізеді

А =E (ab) / н  сt                                          (1)

мұндағы,     А- 1г аспадағы ферменттің белсенділігі;

Е- экстинкция (0,125 немесе 0,250);

а- ерітіндінің көлемі (50 мл);

b- кюветаның реакциондық қоспадағы ерітінді кертартпа дәрежесі;

н- өсімдік материалының аспасы;

с- кюветтегі ерітіндінің қалың қабаты (2см);

t- уақыт, сек.

Зерттеу нәтижесі бойынша пероксидаза ферментінің белсенділігінің өзгеруі каллусты өсіруге арналған қоректік ортаның құрамындағы натрий хлоридінің концентрация мөлшеріне байланысты болды.

Сейтак А, Есенжарова А., Орозалиева Ж.Б. б.ғ.к.

«Национальный центр биотехнологии»  г. Астана 
Тағы рефераттар